【文献】SARS-CoV-2新冠病毒的检测方法

浩浩江水

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今天分享的话题是：新型冠状病毒；检测方法；体外诊断

文献信息








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1. 前言

SARS-CoV-2病毒是导致COVID-19肺部疾病的原因。它于2019年12月在中国武汉首次报告，但迅速传播到世界各地，于2020年3月被列为大流行。对这种大流行的管理主要依靠疫苗接种和预防措施，如保持社交距离和使用口罩。尽管新感染的数量会定期变化，并且我们已经看到存在几个平均间隔为4个月的“波浪”，但始终保持高水平的检测仍然非常重要。由于COVID-19具有高度传染性并呈现非特异性症状，容易被误认为是普通流感，因此拥有现成的特定诊断工具非常重要。目前，有几种检测方法可用，但由于世界范围内的需求，它们的可用性有限，特别是在大流行的第一年。这些限制大多与缺乏设备和试剂、有缺陷的检测试剂盒以及结果前的等待时间过长有关，因此迫切需要开发快速、灵敏且具有成本效益的工具。由于已经证明早期发现对减少病例数量有很大的影响，因此必须提高检测的可用性和特异性，并减少从样本收集到检测结果的时间。大多数检测通常在与阳性病例密切接触的个体以及出现发热、疲劳、干咳和肌痛等症状的个体中进行，这在COVID-19患者中很常见。然而，随着接种疫苗的人数不断增加，有关诊断测试的指南预计将发生变化。



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2.SARS-CoV-2探测技术




图 1 可用不同检测技术和被分析样品的示意图：（A）快速诊断测试，（B）ELISA，（C）PCR，（D）LAMP，（E）CRISPR-Cas

2.1临床上有效的方法

1）抗体检验


这些是血清学测试，用于分析血液或血清样本以检测特定的SARS-CoV-2抗体。这些检测将通过检测是否存在免疫球蛋白G（IgG）或免疫球蛋白M（IgM）来告知一个人是否感染了COVID-19。这些抗体针对Spike（S）和核苷（N）蛋白，并且在IgM的情况下在症状发作后2周和IgG症状发作后3周具有最高水平，后者也提供长期免疫力。检测SARS-CoV-2抗体最常用的技术是酶联免疫吸附测定（ELISA）和侧流免疫测定（LFIA）。

比较两种检测方法，ELISA具有更高的特异性和敏感性。然而，等待时间要长得多（1-5小时），所需的样品量更大，并且有几个手动步骤需要实验室设置和技术人员，这限制了其作为POC测试的使用。特别推荐进行这些抗原检测以确认疑似感染病例。如果结果为阴性，则指示个体进行更灵敏的RT-PCR检测以确认结果，因为结果与临床情况不一致。由于这些测试容易产生假阴性结果，因此它们可能会给人一种虚假的安全感。

2）抗原检验

与抗体检测一样，最常用的抗原检测技术是ELISA和LFIA。当应用于抗原检测时，ELISA测试将使用SARS-CoV-2特异性抗体或其他亲和配体，如适配子或合成肽。如果样品中存在病毒蛋白，它们将识别并与病毒蛋白结合，通常是S或N。建议使用N蛋白作为靶标，因为它在病毒复制过程中含量很高，并且与其他冠状病毒（CoVs）的交叉反应性较低。然而，这些类型的检测受到抗体和表位保存可用性的限制。

3）RT-qPCR


实时逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）是COVID-19最常用的检测方法，由于其可靠性，它被认为是“金标准”。首先，收集用于病毒RNA提取的生物样品。根据美国疾病控制和预防中心（CDC）的建议，样本既可以来自上呼吸道（URT）（鼻咽或口咽拭子）或下呼吸道（LRT）。RNA分离后，分析包括两步过程：逆转录，将病毒RNA转化为cDNA，然后使用特定的引物和探针扩增某些病毒区域，同时通过荧光信号测量扩增水平（图1C）。

以上描述的技术是最常用的，并且已被证明是临床有用的。接下来，将描述一些已开发的技术，即使其中大多数尚未完全提供给公众。尽管如此，它们仍然是潜在的有用诊断工具。



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3. 新冠检测的其他方法

3.1RT-LAMP

与RT-PCR一样，逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）依赖于特异性cDNA序列的扩增来检测SARS-CoV-2（图1D）。该技术使用四到六个引物，反应都在相同的温度下发生;因此，不需要热循环仪或任何昂贵而笨重的设备。结果可以通过凝胶电泳、紫外光照明或基于反应副产物的比色读数获得。后者是最常用的场上，因为它允许在几分钟内获得视觉结果。通常的比色RT-LAMP反应只需要稳定的热源，逆转录酶，DNA聚合酶和pH指示剂来提供颜色变化。从样本收集到结果，反应时间约为40分钟，具有高特异性和灵敏度。这些样品通常是鼻咽拭子或唾液样品，根据所使用的方法，可能不需要先前的RNA提取。引物通常靶向N，S，E或ORF1ab基因中的区域;然而，每种检测方法只能使用一个靶标，这限制了其准确性并增加了假阴性发生的可能性[38]。还开发了一种多重RT-LAMP检测方法，该检测方法可靶向两个SARS-CoV-2区域，从而实现更准确的检测。还有一些测试同时采用CRISPR-Cas和RT-LAMP技术，以规避它们的一些个体局限性。

3.2 CRISPR–Cas

目前，人们对基于CRISPR-Cas的检测方法非常感兴趣，该方法依赖于使用引导RNA和核糖核酸酶来检测特定的RNA靶标。两个例子是特异性高灵敏度酶报告基因解锁（SHERLOCK）和DNA内切酶靶向CRISPR反式报告基因（DETECTR），它们分别使用Cas13和Cas12。这两种方法都依赖于引导RNA检测特定的SARS-CoV-2序列，然后通过Cas12或Cas13触发报告分子的分裂（图1E）。这将引发随后的可检测荧光信号。该测定需要30至40分钟，加上RNA提取，结果可以通过荧光检测或使用能够捕获标记分子的横向流带来观察。

这些方法的优点是：其速度快，不需要设备笨重或逆转录酶反应，成本低，结果解释容易。但是，目标序列选择需要优化。它还需要专业人员进行RNA提取步骤，并且不如RT-PCR敏感。此外，生成的结果仅是定性的，并且每个反应仅报告一个SARS-CoV-2靶序列的结果。



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4.前沿技术方法

4.1 生物传感


生物传感器是一种将生物成分组合在一起以检测分析物的装置，以及用于检测物理化学反应以产生可测量信号的换能器。生物传感器由三个组件组成：生物感受器，传感器和信号处理器。生物受体是一种生物元件，例如核酸探针，病毒蛋白或抗体，它们将识别样品中存在的特定分析物（图2）。分析物与生物受体的结合将导致一种改变，该改变将由换能器检测到。这种变化将被转换为可测量的信号，然后信号处理器将负责其在电子设备上的显示。根据换能器的类型，生物传感器主要可分为电化学、热学、光学或压电式。




图 2.生物传感器设计的示意图。

用于提高灵敏度和降低生物传感器检测极限的技术之一是添加纳米颗粒。纳米颗粒是尺寸为1-100nm的颗粒，也具有特殊的物理化学性质。它们可以由金，银，碳或二氧化硅等材料合成。根据材料的类型，它们可以表现出光致发光、磁性、低毒性、高稳定性或良好的生物相容性和导电性。另一个优点是可以对它们进行化学修饰，以便与核酸探针，病毒蛋白，抗体或其他配体共轭物。有许多基于纳米颗粒的生物传感器正在开发用于COVID-19检测；然而，它们的优点是相同的：快速，低成本，便携，用户友好，高度敏感和特异性。然而，纳米颗粒的使用通常与优化这些系统的需求密切相关，因为它们具有高度未开发的潜力。

4.2测序


测序技术，特别是全基因组测序，是鉴定病毒RNA的最完整和可理解的方法。除了准确的鉴定外，它还允许科学界通过检测新的突变来跟踪病毒的基因组进化。自大流行开始以来，全球在线平台上共享了超过1000万个基因组序列。这种全球合作使科学家能够跟踪流行病学暴发和新变异，从而提高疫苗效率并实施当地预防措施。

然而，由于测序是一种昂贵且缓慢的方法，因此不建议在紧急情况下进行大规模检测。然而，测序，特别是下一代测序（NGS），对于SARS-CoV-2的首次鉴定及其分子结构的表征至关重要。这与病毒培养和电子显微镜一起，使人们对病毒结构及其机制有了更深入的了解。这些技术的使用使得所有诊断方法和治疗策略的发展成为可能。这凸显了这些非正统检测方法的重要性，尽管不适合大规模检测，但在研究背景下仍然是不可替代的。

在表1中，总结了不同SARS-CoV-2检测工具的优缺点。



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5. 测试选择


众多可用的诊断工具证明了全球几个机构在这场大流行期间所做的工作和投资。然而，可用的许多选择也带来了犹豫不决和困惑，即哪种方法最适合每种情况。仅在欧洲，就有超过365项检测被批准并可用于商业化。在特异性和灵敏度、每个结果所需的设备、成本以及每个结果提供的信息方面，测试性能的差异都是在选择最佳选项时需要考虑的变量。每个测试都有一个或多或少的特定时间窗口，其中其结果具有更高的准确性，有时所选的测试对于给定情况根本不是最合适的，这可能导致错误的结果。症状表现、感染时间以及样本的类型和质量是一些可以极大地影响检测结果及其疗效的变量。因此，主要目标是能够在正确的时间对正确的样本进行正确的测试。

根据样品的类型，测试性能可能会有所不同。SARS-CoV-2可在上呼吸道（URT）样本（包括最常用的鼻咽拭子，以及口咽拭子，鼻中鼻拭子，前鼻拭子，鼻咽/鼻腔冲洗液和唾液），下呼吸道（LRT）样本（如痰液和支气管肺泡灌洗液（BALF））以及最后来自血清，尿液， 和粪便。例如，关于分子检测，来自URT或LRT的样本预计将产生更好的结果，特别是在感染后的前两周，由于病毒正在积极复制，因此在症状发作后的前三天达到峰值。在这些样本中，BALF和痰液通常具有较高的病毒载量。在此之后，呼吸道中的病毒载量预计将减少，使用这些样本的测试的准确性也会降低。在长期感染的情况下，获得阳性结果的最佳方法是分析尿液和粪便，因为这些样本在感染1个月后报告了病毒的存在。

关于血清学检测，建议仅在感染后至少两周进行抗体检测。在检测到的抗体中，IgM有望在感染后6周开始减少，而IgG在病原体中停留的时间更长。除了选择适当的样本类型外，还有必要遵循CDC提供的有关收集、运输和储存的适当程序。

图3以简化的方式说明了样品类型，测试与感染后时间之间的关系，以及哪种是检测特定分析物（病毒RNA，抗原或抗体）的最佳选择组合。




图 3.显示有关样品类型，诊断测试和感染后时间的最合适选项的方案，以检测每种分析物：RNA，抗原或抗体（IgM和IgG）。



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6.结论

由SARS-CoV-2引起的大流行凸显了有效检测方法的重要性。虽然有几种技术可用，但COVID-19诊断主要依赖于两种技术：RT-PCR和快速抗原检测，例如LFIA。然而，对其他技术（即生物传感器）的不断研究和开发，不仅为SARS-CoV-2检测，而且对于其他病毒，都提供了广泛的潜在选择。然而，在为每种情况选择最合适的测试之前，必须考虑一些参数。症状的表现、感染时间和样本类型都会影响诊断工具的结果。可能限制测试选择的其他因素包括成本、响应时间、基础设施、设备和专业人员的可用性。此外，新的病毒变异体的兴起是一个挑战，因为它可能会影响目前商业化的诊断测试的有效性。因此，有必要在全球层面对SARS-CoV-2病毒进行最新的基因组监测，因为这是预测COVID-19测试可能失败并进行替代和更新受影响测试的唯一方法。




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参考
[1]Lino, A.; Cardoso, M.A.; Gonçalves, H.M.R.; Martins-Lopes, P. SARS-CoV-2 Detection Methods. Chemosensors 2022, 10, 221.

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